ㄧ、基因編輯技術類型
基因編輯技術讓人類可以改寫DNA的編碼，能在生醫、農業、食品及環保等領域上有許多應用。除了在2020年獲得諾貝爾獎化學獎的CRISPR-Cas9技術外，還有另外兩種基因編輯的技術，分別為ZFNs和TALENs。以下簡單介紹這三種基因編輯技術：

(一) ZFNs (Zinc-finger nucleases, 鋅指核酸酶)
ZFN為最早被發展出來的基因編輯技術。ZFN是一種人工改造的限制酶，包含了可以辨識並與DNA序列結合的鋅指結構與分解DNA的核酸酶(Fokl)結構，一個鋅指結構可以辨識以三個鹼基為單位的DNA序列，一系列的鋅指結構，則可以專一性的辨識長序列DNA。同時，Fokl核酸酶完整的作用需形成二聚體，因此需要一對ZFN才能夠進行基因編輯。ZFN優點為設計簡單且分子小，容易透過載體遞送，另外低免疫原性也是一優勢。缺點則有較低的標靶能力、時常有脫靶的情形造成不必要的DNA斷裂，與一次只能定位一個DNA位置。

(二) TALENs (Transcription activator-like effector nucleases, 類轉錄活化因子核酸酶)
TALEN與ZFN的概念與結構相似，TALEN是由可辨識單個核苷酸的TALE蛋白和Fokl核酸酶所組成的融合分子。以TALE陣列形式能辨識更長的DNA序列。另外，與ZFN系統相同，Fokl核酸酶的作用亦需形成二聚體。與ZFN相比，TALEN設計較簡單，專一性更高，不過TALEN分子比ZFN大，遞送難度較高。此外，ZFN與TALEN均只能進行簡單的突變，且有一定比例的脫靶情形，造成許多風險，目前不適合用於人體。

(三) CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated proteins, 常間回文重複序列叢集/常間回文重複序列叢集關聯蛋白系統)
CRISPR-Cas9系統包含兩種重要分子，分別為引導核糖核酸(guide RNA，gRNA)以及Cas9。gRNA可以辨識目標序列；Cas9為一種能夠切割DNA的酶。gRNA與Cas9結合後，就能夠辨識與剪切有缺陷的DNA序列，並進一步修補成為編輯後的目標序列。CRISPR-Cas9設計簡單，並且可以同時使用兩個以上的gRNA來進行多個基因的編輯；不過相較於ZFN與TALEN，Cas9分子更大，因此CRISPR-Cas9系統的遞送為重要挑戰。

二、基因編輯技術研發重點
由於CRISPR-Cas9使用門檻與成本均較低，且效率也較高，因此是目前最廣泛的被使用的基因編輯技術。以下將介紹CRISPR-Cas9技術的各項研發重心：

(一) 新型CRISPR酵素
CRISPR-Cas9技術有著能夠治療各種基因相關疾病的巨大潛力，不過該技術潛在的脫靶問題以及非特異性的基因編輯事件可能會在治療應用上產生許多安全性的疑慮。設計新型Cas核酸酶或變體，可望能減少脫靶效應的產生，例如近期發展的dCas9, Cas12a, Hifi Cas9, Cas14及CasΦ等新型Cas分子，另外新的gRNA設計也能降低脫靶效應的發生。

(二) 遞送技術的提升
將CRISPR/Cas9傳遞到目標器官的效率會影響其治療的效果，不過由於Cas9是一個大分子，很難透過常用的腺相關病毒(Adeno-associated viruses, AAV)載體來包裝與遞送。不過目前透過基因工程的方式能開發出進階的AAV載體來解決這樣的限制，如雙載體法與沒有包裝限制的載體。另外也有其他非病毒載體的開發，如脂質奈米顆粒(Lipid nanoparticles, LNP)、聚合物包裝的載體或工程化類病毒顆粒(Engineered virus like particle, eVLPs)、奈米級電穿孔與微流體收縮(Microfluidic constriction)等。不過Cas9核酸酶的表現時間長短會影響CRISPR/Cas9工具的效率，若表現時間太長也會增加脫靶事件的發生，因此也有開發出各種自我限制或是自我去活化的CRISPR/Cas9技術，以降低CRISPR/Cas9於體內的表現時間。

(三) 新型的基因編輯技術
傳統的CRISPR-Cas9技術透過剪斷特定序列的DNA序列，再透過細胞的DNA修補機制，將目標序列與原本的DNA序列接合，達到基因編輯的目的。前述方法須依賴細胞DNA修復機制的完整性，因此效率較低，且有較高的脫靶機率，在人體使用上有安全的疑慮。經過研究人員們的努力，目前已開發出以下數種進階的CRISPR-Cas9基因編輯技術：

(1) Base editing
經改造後的CRISPR-Cas9系統可以透過Base editing來進行單鹼基的基因編輯。只剪斷一股的DNA，並直接進行單鹼基的置換，而不需提供正確序列與依賴細胞的DNA修復機制。不過這樣的Base editing功能只侷限在A到T或C到G等單鹼基的編輯，無法處裡較複雜的突變形式。

(2) Prime editing
Prime editing技術加入了反轉錄酶(Reverse transcriptase)，並且在gRNA後加上了欲編輯的目標序列，稱作pegRNA，能夠直接再欲編輯的區域進行反轉錄反應生成目標序列後並取代原來的序列，這樣的方法使Prime技術能應對各種基因突變的組合與編輯較長的DNA序列，限制為約80個鹼基對的序列。

(3) Gene writing
Gene writing是基因編輯領域新興的技術之一，能夠成為治療其他基因醫學無法治療疾病的方法。該技術利用自然界中存在的一種基因種類，稱為可動遺傳因子(Mobile genetic elements, MGE)(人體基因體中約有50%屬於MGE)。MGE能夠讓基因片段在體因體中轉移。透過使用這樣的機制，可以運送目標DNA序列，並將其傳輸到想要的位置上，達成編輯基因的目的。

(4) Twin Prime Editing (TwinPE)
TwinPE透過一對的Prime editor與pegRNA組合，分別在基因組內創造兩個DNA缺口，並替換其中序列為與pegRNA互補的DNA序列，此方法可以突破Prime editing技術的限制，將可編輯的鹼基對提高到數百個。

(5) Programmable addition via site-specific targeting elements (PASTE)
建立在CRISPR基因編輯的基礎上，麻省理工學院的研究人員設計出了PASTE，可以更安全，更有效的替換掉有缺陷的基因。使用這個系統，研究人員表示他們可以將長達36000個鹼基對的DNA序列傳遞給幾種人類細胞以及小鼠的肝細胞。這樣的技術有希望被用來治療由大量突變的基因缺陷所引起的疾病如囊腫性纖維化(Cystic fibrosis)。

前述新興編輯技術各有其優勢，目前採用Base editing與Prime editing技術的療法正在進行臨床試驗。

三、基因遞送技術發展進展
基因編輯本身技術的不斷創新及發展，目前較廣泛使用的基因編輯如治療鐮刀型貧血(Sickle cell disease)或是嵌合抗原受體T細胞療法(Chimeric antigen receptor T cell, CAR-T)，均為離體(Ex Vivo)進行的方式。離體進行有著較安全與較好進行品質的管控等優勢，不過也有著僅適用於能夠在體外培養的細胞種類上的限制。細胞或組織無法於體外培養的疾病則必須用體內基因編輯的方式來治療，為了進行體內基因編輯，基因編輯工具必須成功傳遞到目標細胞內，這樣的需求促使了基因編輯遞送技術的發展。以下列出數種重要的基因遞送技術：

(一) 病毒載體
腺病毒(Adenoviral vectors)、腺相關病毒(Adeno-associated viruses, AAV)與慢病毒(Lentivirus)是常用的病毒載體。使用病毒載體雖然有效，不過使用時會有包裝容量不足與免疫原性等問題。另外，使用病毒載體可能會造成Cas9的過度表達，造成更多非專一的DNA斷裂事件的發生。可以加入帶有可切除Cas9編碼序列的gRNA，讓細胞可以在體內自行去除製造Cas9的序列，可以在不降低基因編輯效率的情況下降低後續不必要的反應。

(二) 脂質奈米顆粒(Lipid nanoparticle, LNP)
和病毒載體相比，LNP具有較小的免疫原性與應用的靈活性，其轉染形式為短暫轉染(Transient transfection)，不易有過度表達的現象，因此在應用上也較安全，但LNP的遞送效率較病毒載體差。近年來在LNP表面修飾的能力上不斷進步，這可以幫助開發出標靶特定器官或組織的LNP，提升體內基因編輯的精準度。

(三) 外泌體
外泌體是由細胞所釋放的奈米級囊泡，用來促進細胞之間的通訊。由於是人體細胞生成的，外泌體有著生物可降解、低細胞毒性，並且可克服免疫原性等其他載體很難克服的問題。近期研究結果已經成功將從Cas9 RNP(Ribonucleoprotein,核蛋白)地送到目標細胞中，顯示外泌體作為載體的潛力。另外，外泌體可以與脂質體或是聚合物混和後形成雜交型的外泌體，其特殊的膜構造可以提高它的負載能力。

(四) 聚合物
類似脂質載體，聚合物形成的奈米顆粒載體通過胞吞作用來遞送其貨物到細胞內，並能保護貨物被免疫系統攻擊和被核酸酶降解。聚合物載體有著易於修改及修飾來增加標靶能力，較高的裝載量等優勢。聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine)及殼聚糖(Chitosan)是最常被使用於CRISPR-Cas9的聚合物載體。

(五) 胜肽
基因編輯工具能夠以RNP形式運作，並透過與細胞穿透胜肽(Cell-penetrating peptides, CPPs)形成複合體來遞送至細胞內，不用被脂質體或聚合物載體所包覆。研究中，經過凍融循環後的CPP-Cas9-RNP複合物在編輯基因的功能上還保有高穩定性及效率，顯示了CPP用來運送基因編輯工具的潛力。

(六) DNA奈米粒子
將DNA分子依不同空間結構組合，能夠設計出各種DNA奈米結構粒子，如DNA四面體(DNA tetrahedrons)、DNA摺疊結構(DNA origami structures)、DNA奈米機器人(DNA nanorobots)及DNA奈米線團(DNA nanoclews)等。具備尺寸多樣性以及生物可降解等特性，DNA奈米粒子具備作為CRISPR-Cas9系統的遞送工具的潛力。近期一項發展是透過球形的奈米顆粒來遞送CRISPR-Cas9基因編輯工具，並在多個人類和小鼠細胞株中得到正向的結果。

三、代表性案例

(一) Prime Medicine
美國的Prime Medicine是一家基因編輯新創公司，也是第一家利用Prime editing系統中的技術開發新類型單次性基因療法的公司。其平台PASSIGE (Prime Assisted Site-Specific Integrase Gene Editing)技術，能夠將較大型序列引進基因組中。該公司持續開發及強化其基因編輯工具平台，並預計於2024年開始進行新藥臨床試驗(Investigational new drug, IND)的申請。

(二) Verve Therapeutics
美國的Verve Therapeutics是一家臨床階段的基因編輯公司，利用Base editing技術來開發心血管疾病的治療方法。其基因編輯療法主要針對兩個與動脈粥樣硬化心血管疾病(Atherosclerotic Cardiovascular Disease, ASCVD)發生相關的血脂調控基因，分別為PCSK9與ANGPTL3。開發中的療法VERVE-101與VERVE-201目前分別處在臨床試驗第一階段與IND申請的階段，其中VERVE-101能夠降低患者血液中90%的低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)的量。

(三) Scribe Therapeutics
美國的Scribe Therapeutics旨在開發適用於神經系統疾病、眼科、肌肉與代謝、造血相關等疾病的療法。該公司開發的X-editing是一個高度工程化的CRISPR-Cas9分子，能提供比傳統CRISPR-Cas9系統更高的效率、專一性與遞送能力。目前Scribe Therapeutics與Sanofi合作，共同利用X-editing系統開發多種癌症相關的基因療法。